혐기성 세균 종류 분리 동정 정리 / Clostridium spp. 분리 동정 / Bacteroides, Provotella, Fusobacterium

혐기성 세균의 분리와 동정 Isolation and identification of anaerobic bacteria

1. 산소와 세균 증식

1) 편성 혐기성균 : 유리산소 환경하에서는 절대 발육하지 않는 균
 2) 통성 혐기성균 : 유리산소 접촉과 관계없이 발육하는 균
 3) 편성 호기성균 : 유리산소와 꼭 접촉해야만 발육하는 균. 반유동배지의 표면에만 발육한다.
 4) 미호기성균 : 약간의 산소를 요구하는 균. 혐기성을 요구하는 정도가 그리 심하지 않는 세균. 반유동배지의 표변 바로 밑에 성장

1. Oxygen and bacterial growth

1) Organized anaerobic bacteria: bacteria that never develop in a free oxygen environment
 2) Painful anaerobic bacteria: bacteria that develop regardless of contact with free oxygen
 3) Organized aerobic bacteria: bacteria that develop only when they come into close contact with free oxygen. It develops only on the surface of semi-fluid medium.
 4) Microaerobic bacteria: bacteria that require a little oxygen. Bacteria that are not so severe that they require anaerobicity. Growth just below the surface of semi-fluid medium

2. 혐기성 세균 감염

- 악취가 나고 외양이 농성이며 괴사조직, 가스 혹은 유황과림이 있을 때 혐기성 감염을 의심.
 - 혐기성균은 상재균(사람의 구강, 인두, 소화관, 외요도, 자궁경부, 질, 피부 등)이므로 상재균이 없는 재료로써 혈액, 수액, 복        수, 흉수 등의 천자액, 폐쇄성 농양 등을 이용해 검사한다.(Clostridium속은 토양 중에 상재하는 균이 많다.)
 - 저항력이 낮은 사람이나 수술을 받은 사람 등에 감염을 일으키는 중요한 기회감염균
  ① 유아포 형성하는 Clostridium속에 의한 감염증 : 파상풍, 가스괴저, 보툴리누스 식중독, 위막성 대장염
  ② 무아포 혐기성에 의한 감염증 : 내인성 감염증

2. Anaerobic bacterial infection

-An anaerobic infection is suspected when there is a foul odor, a purulent appearance, and necrotic tissue, gas or sulfurous forest.
 -Since anaerobic bacteria are superficial bacteria (human mouth, pharynx, digestive tract, external urethra, cervix, vagina, skin, etc.), it is a material that does not contain superficial bacteria. (The genus Clostridium has many bacteria living in the soil.)
 -An important opportunistic infectious bacteria that infects people with low resistance or who have undergone surgery.
  ① Infectious disease caused by Clostridium genus that forms infantile blisters: tetanus, gas gangrene, botulinum food poisoning, pseudomembranous colitis
  ② Infectious disease caused by anaerobatic anaerobic: endogenous infection

 3. 산화 환원 전위(rH)

  ① 혐기성균은 낮은 산화 환원 전위가 아니면 발육하지 못한다.
     rH 12 이상에서 호기성이 발육
     rH 10～12에서 수소성 미호기성균이 발육
     rH 7.4 이하에서 편성 혐기성이 발육
  ② 혐기성 배지의 산화 환원 전위를 낮추는 물질로 sodium thioglycollate, cysteine, sodium sulfite, sodium bisulfite, sodium formaldehyde sulfoxylate 등을 0.1～0.01% 첨가
  ③ 환원물질이 첨가된 배지의 공기에 노출시 급속히 과산화물이 형성. 이것은 혐기성균의 증식을 강하게 억제한다.

☞ 평판배지가 굳은 뒤 곧 혐기성 jar에 넣으면 증식 저해 물질의 형성은 적다.

3. Redox potential (rH)

  ① Anaerobic bacteria cannot develop unless they have a low redox potential.
     Aerobic development at rH 12 or higher
     Hydrophobic microaerobic bacteria develop at rH 10-12
     Knitted anaerobic development is developed at rH 7.4 or less.
  ② Add 0.1~0.01% sodium thioglycollate, cysteine, sodium sulfite, sodium bisulfite, sodium formaldehyde sulfoxylate, etc. as a substance that lowers the redox potential of anaerobic medium.
  ③ Peroxide is formed rapidly when exposed to the air in the medium to which the reducing material is added. This strongly inhibits the growth of anaerobic bacteria.

☞ If the plate medium is hardened and put into an anaerobic jar immediately, the formation of substances that inhibit proliferation is small.

4. 혐기성 배양

 1) 분리배양용 배지
  (1) 증균배지
   ① Thioglycollate broth
     - 산화환원전위를 낮게하는 Sod.thioglycollate와 cycteine이 첨가
     - 미량(0.075%)의 agar 존재 → 산소차단효과
     - 산화 환원 전위 나타내는 지시약 : Methylene blue(산소를 만나면 무색에서 blue로), Resazurin(산소를 만나면 무색에서 red). 지시색이 30% 이상이면 끓여서 서서히 식히면 다시 환원한다. 
   ② Chopped(Cooked) meat glucose broth
     - Clostridium 배양에 좋다.  
   ③ Prereduced anaerobically sterilized(PRAS) broth
  (2) 비선택 배지
   ① GAM(Gifu Anaerobic Medium)
     - 반유동배지로 Deep Agar(thioglycollate broth에 한천을 0.2% 정도 넣어 산소가 배지속으로 녹아들어가는 것을 방지하여 rH를 낮게 유지).
  (3) 선택배지
   ① Kanamycin Vancomycin Blood Agar(KVBA) : 혐기성 Gram(-) 간균이 선택적으로 발육 Bacteroides는 색소 생성이 빠름
   ② Bacteroides Bile Esculin Agar(BBEA) : B. fragilis(black colony)
   ③ Phenyl Ethyl Alcohol Blood Agar(PEBA) : Proteus의 유주현상 억제

 2) 혐기성 배양법
  (1) Anaerobic jar 배양
    - CO2와 H2 gas 사용
    - 혐기성 지시약 : Methylene blue(탈색되어 무색→산소에 의해 청색)
  (2) Gas pak jar 배양
    - Gas pak : H2, CO2 생성
    - 촉매제 : palladium
    - Pak에 물 10ml 첨가한 후 jar에 넣고 밀봉하면 gas pak에서 H2와 CO2 생성. H2와 jar 안의 O2가 반응하여 H2O 생성.
  (3) Anaerobic chamber(glove box) 배양
    - N2 80%, H2 10%, CO2 10%의 혼합가스와 palladium 촉매에 의해 자동으로 항상 혐기성으로 유지된다.
    - 혐기성 상태 확인 : Methylene blue paper(1～2일마다 새것을 바꾸며 혐기상태 확인) 
  (4) Bio-Bag법(Gas pak pouch)
    - Resazurin 지시약이 든 앰플과 가스 발생 앰플이 함유 
    - 가스 발생 앰플을 깨뜨리면 30분 이내에 혐기성 상태가 된다.
  (5) PRAS(Pre-Reduced Anaerobically Sterilized)배지법
    - Roll streak법
    - 배지 제조, 접종시 산소에 노출되지 않도록 함.
 

5. 혐기성 세균의 동정방법

 1)간이동정
   ① BAP 성상 : 집락형태 : 크기, 형태, 색
                 색소생성 : Prevotella (Bacteroides) melaninogenia (검은색)
                 용혈 : 이중용혈 (Clostridium perfrigens)
   ② Pitting : B.ureolyticus (혐기성), Eikenella corrodens (통성혐기성)
   ③ 형광 : Prevotella melaninogenia
   ④ Catalase ⊕ : B.frogilis
      Catalase ⊖ : Clostridium 등.
 2) 확인동정
   ① 생화학적 시험용 기초배지 
   ② Kit법 
   ③ Gas liquid chromatography(GLC)
 3) 전통적 감별시험
   ① 염색성 : Gram 10%, KOH이용(균이 loop를 따라 올라오면 Gram(-)
               아포․협막
   ② Biochemical identification test
    ⅰ) Lecithinase 시험 (Nagler reaction)
      a) 배지 ⋅난황 한천배지 ( egg yolk agar)
              ⋅Nagler reaction
      b) C.perfrigens type A antitoxin + lecithinase → Clear
         Half plate without antitoxin + lecithinase → Spread (turbid) 
          → Lecithinase 양성 
      c) egg yolk agar ⋅Lecithinase - (+)일 때 유백색의 불투명대(C. perfringens) Lipase : 집락표면 진주층 /proteolysis : 집락주변 투명

혐기성 세균

1. 그람 양성 구균
  : Peptococcus, Peptostreptococcus
 1) Peptpcoccus
  ① 구강 장관계, 비뇨 생식계, 피부 등의 상재균으로 농의 분비물, 혈액 등에서        잘 분리
  ② 호흡기 감염증, 여성 생식기 감염증, 골수염, 화농성 관절염
  ③ 비용혈성, 당발효 음성, catalase 양성이 많다.
 2) Peptpstreptococcus
  ① 구강, 소화관, 비뇨 생식기
  ② 심내막염, 폐혈증, 폐렴, 폐화농증, 화농성 질환 → 악취가 심함
  ③ Thioglycollate broth에서 gas와 악취
  ④ 연쇄상 형태, catalse 음성, 당발효 양성

2. 그람 음성 구균
  : Veillonella, Acidaminococcus, Magasphaera
 1) Veillonella
  ① V. parrula - wood lamp : 적색형광으로 사람의 구강에서 거의 100% 산출되고  쌍구균, catalase 및 oxidase 음성이 나옴 또한 질산염 환원, 탄수화물 발효 음성
 2) Acidaminococcus
  ∙ 하부 소화관 상재
  ∙ 탄수화물 발효 음성
 3) Magasphaera
  ∙ 하부 소화관 상재
  ∙ 탄수화물 발효
  ∙ Caproic acid 생성 

3. 그람 음성 간균
  : Bacteroides속, Provotella속, Fusobacterium속  
 1) Bacteroides속
  ① B. fragilis
   - 20% bile - growth well(BBEA 배지에서 black colony)
   - colistin 10㎍ disc - resistant
   - 임상 검체에서 분리되는 혐기성균의 30～50%
   - 소화관, 대장, 외음부, 질, 요도에 상재(소장의 정상 세균총)
   - 복강내 감염증의 원인균(기회감염)
   - 항생제 내성이 크다 (내성 : colistin, kanamycin, vancomycin, penicillin.
                         감수성 : erythromycin, rifampin)
   - 비운동성, 비용혈성, 혐막존재, catalse(+), indole(-)
 2) Provotella속
  ① P. melaninogenica
   - 사람, 동물의 구강, 인두, 상기도, 장관, 질에 상재
   - 호흡기 감염증, 폐화농증, 폐렴, 성기 감염증 등의 원인균
   - 혈액한천배지에 3～7일간 배양시 흑갈색 내지 흑색 집락
   - 담즙에 의해 억제
   - 비운동성, catalase(-), hemin, Vit. K 필요
 3) Fusobacterium속
   - 분포 : 사람의 구강내, 상기도, 소화관, 질, 외요도에 상재
   - 병원성 : 폐렴, 호흡기 감염증, 여성생식기 감염증, 간농양, vincent angina(F. nucleatum에 의한)
   - 형태 : 균체내 화성성 과립이 보이기도 함
   - Colistin, kanamycin, penicillin에 감수성, indole(+)
  ① F. nucleatum : 양선단이 뾰족한 방추상(fusiform), 창상감염에서 necrosis
                   20% bile - no growth
                   colistin 10㎍ disc - susceptible
                   Indol(+) Fusiform
  ② F. necrophorum
4. 혐기성 무아포 그람 양성 간균
  : Bifibobaterium, Eubacterium, Propionibacterium, Arachnia, Actinimyces
5. 혐기성 유아포 그람 양성 간균(Clostridium spp.)
 혐기성 유아포 그람 양성 간균/ 막대균 분류 및 특징

※ Sal : salicin
※ A : acetic acid, P : propionic, B : butyric acid, 4종 이상을 생성하는 것은 혼합산

 1) C. tetani
  ∙ 형태 : 북채모양(drum stick form)
  ∙ 아포 단재성 : 주모성 편모
  ∙ β용혈성, swarming 현상
  ∙ Indole(+)
 2) C. botulinum
  ∙ 병원성과 독소 : 균체 외독소(neurotoxin) 생성, 식중독, 창상 보툴리눔증, 영아 보툴리눔증
  ∙ 형태 및 배양 : 주모성 편모, BAP에서 완전용혈(β용혈)
  ∙ 생화학적 성상 : lipase(+), gelatin액화(+), glucose, maltose 분해, gas(+)
 3) C. perfringens(C. welchii)
  ∙ Clostridium에서 분리 빈도 가장 높다(50%)
  ∙ 병원성 : 가스괴저(근육괴사, 대량의 가스 생성, A형 독소에 의한 전신 증상), 식중독(A형 독소), 일반적인 감염증.
  ∙ BAP에서 double zone hemolysis
  ∙ Nagler 반응 : α-toxin에 의한 lecitninase C의 반응(독소가 lecithin을 분해)
  ∙ 당을 발효하여 산, gas 생성(당이 없는 배지에서는 spore를 잘 형성하지 않는다).     
  ∙ 산과 gas에 의한 우유단백 응고 → Stromy fermentation(litmus milk medium)
  ∙ reverse CAMP test 양성

4) C. difficile
  ① 병원성 : 사람이나 동물의 장관에 상재. 음식물 섭취보다는 항생제 오․남용으로 인한 기회감염. 위막성 대장염 원인균. 
  ② 배양 : CCFA(cycloserine cefoxitin fructose agar)에서 잘 자라며 노란색 집락
  ③ 생화학적 성상 : lecithinase(-), lipase(-), glucose, fructose, mannitol분해
  ④ 혈청학적 진단 : latex 응집반응으로 독소를 생성하는 균주인지를 확인.
  ⑤ Actinimyces
   ∙ 혼합감염 : 호기성과 같이 감염되어야 잘자람(대사산물 이용)
   ∙ 방선균증 : 유황과립(Sulfur granule)
   ∙ 집락 : 여방인 어금니 모양(molar tooth) 7일간 배양, Micro-spider-like colony(24～48hrs)

배지
  ∙ BAP
  ∙ PEBA
  ∙ Egg yolk agar(lecithinase, lipase, proteolysis)
  ∙ CGFA(cycloserine, cefoxitin, fructose agar : C. difficile)
  ∙ looked meat medium : 아포를 보기위해