전기영동 Electrophoresis 임상화학 총론

전기영동(EP)

전기영동은 등전점(PI)를 기준으로 완충액의 PH가 Acid(산)의 H+(수소)를 이용해서 양전하(+)의 성질을 띠게 되어서 음극(-)으로 이동하게 됩니다. 반대로 PH가 Alkali(알카리)일 경우에 OH-의 성질을 이용해서 음전하(-)성질을 띠게 되어서 음극(-)에서 양극(+)으로 이동하게 되면서 단백질이 분리되는 방법입니다 

임상화학에서의 전기영동은 단백질(혈장, 혈청)이나 CK, HDL-CHO, LDH, ALP 등 동질효소 분획과 Lipoprotein(지단백질)과 당화혈색소(HbA1C), PCR 등의 유전물질 분석에 이용하게 됩니다

전기영동에 영향을 주는 인자

• 지지체의 종류
• 분자량
• 분자의 크기
• 시료의 점도
• 온도
• 분자형태
• PH
• 이온강도
• 등전점
• 전압,전력의 세기
• Wick flow현상(과류현상)
  (1) Cellulose Acetate 전기영동에서 뚜렷하다.
  (2) 전기영동을 하는 동안에 발생되는 열에 의하여 지지체의 용매가 증발하면, 이것의 손실을 보상하기 위해 양극이나 음극의 완충액으로부터 용매가 지지체로 흘러 들어가는 것.( 찌그러진 영동상을 보임)

지지체의 종류 (Supporting media)

(1) Cellulose Acetate (CA) - 단백질 분획, 동위효소 분석 이용
   ① 미량의 검체 사용 (1~3ℳL)
   ② 영동시간이 짧다 (약 40분)
   ③ 분획이 명료하게 분리되고 재현성이 좋다
   ④ 시료나 색소의 흡착이 없다
   ⑤ 투명화할 수 있기 때문에 Densitrometry를 할 수 있다
(2) Agrose - 아갈로스 겔 (많이 사용 한다.) - 단백분획, isoenzyme분석, Lipoprotein 분석이용
   ① 중성이다
   ② 전기삼투현상 작다
   ③ 항원과 반응하지 않는다
   ④ 투명하고 강한 Gel을 형성한다
   ⑤ densitometry를 할 수 있다
   ⑥ 미량의 검체를 사용
   ⑦ 영동시간이 짧다
   ⑧ 오랫동안 저장하여도 탈색 되지않는다
(3) Cellulose Polyacetate
(4) Agar Gel
(5) Starch
(6) PAGE(Poly Acryl Amide Gel)

전량, 분자량,전압,전류에 의한 인자

검체의 성질에 있어서는 물질이 띠고 있는 전기의 량( 대전량)이 크면 클수록 이동하는 속도가 빨라진다 그래서 대전량이 클수록 속도가 빨라지는 비례관계를 나타내며 크기에 있어서는 분자량이 크면 클수록 이동속도가 느려지는 반비례 현상이 일어납니다 또한 분자의 형태와 구조에 있어서는 다양하나 이동속도에 영향을 주게 됩니다.

전장(electric field)은 전압과 전류와 저항에 의한 관계를 설명하려고 합니다. 전압(voltage)를 높여주게 되면 이동속도가 빨라지는 비례 관계가 있으며 전류(A)를 높여주면 이동속도가 빨라지는 비례현상이 일어나게 됩니다. 하지만 저항이 높아지게되면 이동속도가 느려지는 반비례 현상이 나타나게 됩니다

완충액(Buffer)의 영향

★★Barbital buffer = Beronal buffer(알카리 , PH 8.6!!! 가장많이많이 사용하는 전기영동 완충액) - cellulose acetate막. paper

(1) buffer의 종류
   ① Acetate Buffer (acid)
   ② Barbital Buffer = Veronal Buffer (alkali, ph8.6, 가장 많이 사용)
   ③ Tris Buffer (alkali)
   ④ Phosphate Buffer (중성)
(2) Buffer의 pH의 영향
   ① 등전점을 기준으로 buffer의 ph에 따라 검체의 +,- 결정
   ② 등전점보다 Acid 이면 +극에서 -극으로 이동*
   ③ 등전점보다 alkali이면 -극에서 +극으로 이동*
(3) buffer의 농도의 영향
이온강도(0.06~0.07mol)가 높으면 이동속도가 느리다(반비례_) = 단백질 전기영동에서 사용하는 인산완충액의 이온강도는 0.05-0.07!!! 반대로 이온강도가 낮으면 이동속도 빠르다

μ =

 { μ = 0.06: Ionic Strength (이온강도), C: 몰농도, Z: 이온가(하전량)}

단백질의 등전점(Isoelestric Point: PI) : PH 4.9

양극과 음극의 평형이 될 때 단백질은 움직이지 않게 되는데 이때의 ph를 등전점이라고 합니다 단백질 전기영동시 알부민 PH4.9, a1: 5.0 , a2:5.0 ,β : 5.12 , γ:5.7-7.0 의 등전점을 가지고 있습니다

전기삼투압(Electroendosmosis)현상

electrophoretic mobility가 낮은 단백은 +극으로 이동하지 못하고, 표면에서 발생한 +로 이동하여 마치 -극으로 이동한 것처럼 보이는 현상으로 전기적 삼투압을 감안하여 지지체의 종류의 따라서 시료의 도포위치를 다르게 하는것이 합당합니다 이 물질에는 하전량이 큰 물질인 감마-글로불린이 있으며 지지체에 따른 전기삼투압이 심한것은 agar gel, paper, cellulose acetrate, agarose gel, starch gel, polyacryamide gel의 순서로 있지만 가장 심한것은 agar gel 입니다. 그래서 도포지점을 1/3지점에 하게 되면 가장 좋은 결과를 얻을수 있습니다

전기삼투현상으로 단백질이 양극으로 가야되는데 음극으로 이동하는 현상

전기영동 과정(총 단백질 분석과정)

1) 과정
(1) cellulose acetate를 barbital buffer(ph8.6~8.8)에 잠시동안 담궈놓는다.
   담을 때 지지체 표면에 기포가 생기지 않도록 주의한다.
(2) cellulose acetate에 묻어있는 물기를 filter paper로 제거한다.
(3) cellulose acetate 한쪽 표면에 applicator를 사용하여 검체를 Spot한다.
(4) 검채를 spot한 쪽이 -극쪽으로 향하게 하여 cellulose acetate를 뒤집어서 chamber에 올려놓고 migration시킨다. 즉, 통전시킨다.
(전류는 -극에서 +극으로 흐른다. voltage :220volt, 시간:25분)
(5) 전기영동이 끝난 다음 즉시 규정에 따라 염색을 한다.
 염색액의 종류
    * Ponceau S (red) - 폰소우 ( 최종색 :  red)
    * Ponceau 3R (red)
    * Amino Black (blue) - 아미도 블랙 (최종색 ; blue)
    * Coomassie Brilliant Blue - 쿠마시브릴리언트 블루 R250
    * Brom Phenol Blue - 브롬 페놀블루 : 전기영동시 검체가 얼마나 움직였는지 (진행정도를 파악) 하는 염색약     
    * Lissamine Green
    * Nigrosine 
    * Azocarmine
    * Acid Fuchsin

 (6) 염색이 끝난 cellulose acetate를 5% HAC (빙초산: Glacial Acetic Acid) 넣어 염색  된 단백부위 
    이외의 색소를 탈색시킨다
(7) filter paper로 물기를 제거한다. (탈수) _ gel 없애는 과정
(8) 결과 관찰
   ① 분획별 추출법
      ⓐ 탈색이 끝난 cellulose acetate를 마르기전에 각 분획별로 자른다
      ⓑ 0.01N NaOH 5ml씩 들어있는 각각의 Tube에 담궈서 각각의 색소를 추출한다
      ⓒ Spectrophotometer를 이용하여 525nm에서 각 Tube의 흡광도를 측정한다
      ⓓ 모든 흡광도를 더해서 이것으로 각 분획의 %를 낸다
   ② Densitometry(EP의 가장 마지막 단계)를 이용하여 Dencitrogram를 보고 판독한다