그람 염색은 병원 미생물학을 공부할 때 기본적인 염색법입니다.
gram stain의 목적
미생물학을 전공하시는 분들과 임상병리사, 임상병리학생들 , 자연공학 계의 미생물 연구하는 분들에게도 꼭 필요합니다. 그이유는 이 gram stain 은 바로 배지에서 추출된 균들의 종을 구별하는 염색법이기 때문입니다. 차등염색법에 따라서 Gram positive ( 그람양성 ) 인지 , Gram negative (그람음성) 인지 구별할 수 있으며 , 형태에 따라서 알모양의 cocci인지, 막대모양의 bacili인지 구별하는 염색법 입니다.
여기서 구별이 된다면 호기성, 혐기성으로 세균이 나뉘게 되고, 또 나뉘게 되면 어떠한 특별한 test과정들을 통해서 균을 찾아내게 됩니다. 저는 지금부터 gram stain을 하는 gram stain의 방법을 소개하고자 합니다.
gram stain의 방법
먼저 준비물에 있어서는 아래와 같이 라벨용 슬라이드와, 검체, 시약이 필요하게 됩니다. 시약으로는 crystal violet과 iodine, alcohol과 safranin O 의 4가지 염색제가 필요합니다.
먼저 백금이를 통해서 검체를 살짝 뜬 다음에 슬라이드에 검체를 도말해줍니다. 그 후에는 도말된 슬라이드를 건조시키고 열을 이용해서 가열로 고정을 시켜줍니다. 그다음에 염색이 시작됩니다. 검사에 있어서는 염색제도 중요하지만 시간또한 중요한 것을 알아야합니다. 만약 주 시약인 Crystal violet 이 과도하게 염색이 될 경우(착색) 그람 음성 이여야 할 (빨강색 균)이 푸른색으로 잘못나오게 되면 검사 결과 자체가 틀려지기 때문에 주의하고 검사를 해야합니다.
Crystal violet 은 주 염색약으로써 1분간 반응해주게 됩니다. 그리고 iodine은 우리가 아는 요오드입니다. 씻어낸 주시약 위에 반응을 해주되 이것 또한 1분간 반응을 해줍니다. 다음으로는 alcohol입니다. 알코올은 전에 염색제를 과도히 반응을 할 경우에는 전에 염색제들이 씻겨 나가기 때문에 반응시간을 짧게해주셔야 합니다. 10초입니다. 마지막으로 safranin O같은 경우에는 대조염색제로써 30초간 반응시킨 후 경검을 하게 됩니다.
gram stain의 후
염색이 다 끝난 후에는 마른 상태로 100x에 맞춰 경검을 하게 됩니다. 이 때 페이퍼로 렌즈를 닦아주고 오일을 뿌린 후 관찰 하게 되면 푸른색, 빨강색으로 나오는 균을 보게 될 것 입니다. 그람 염색을 통해서 미생물의 전문가가 되봅시다^^
질문/답변 감사합니다!!
Q. crystal violet 을 떨어뜨린 후 반응 후 물로 씻는 이유가 뭔가요?
crystal violet의 염색제 색깔이 강한 보랏빛을 나타나게 됩니다. 수세과정 없이 진행이 된다면 음성균인 경우에는 탈색이 되더라도 주변에 남아있는 crystal violet 염색제와 대조염색(safranin O)를 했을 때 그람음성균의 검체(red)가 그람양성균(violet)으로 잘못 판독이 될 수 있습니다.
Q. 열고정을 오래하면 왜 염색이 잘못되나요? 어떻게 잘못되고 왜 잘못되는건가요?
열처리를 오래하면 균의 세포벽이 손상됩니다. 그래서 원하는 대로 염색되지않을 수 있으며
또한 균종에 따라서 세포벽의 특징들이 다르기 때문에 그 차이도 존재합니다. 열처리는 세균의 수분을 없애는 과정으로써 고정하는 단계입니다. 그리고 슬라이드가 깨질 수 있으며 세균까지 타서버릴 수 있기에 정확히 구별하기 어려울 수 있습니다
완전 쉬운 동영상 강의 보러가기 https://youtu.be/Qz2P4T6B2k
